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Aparecendo na superfície pela primeira vez em seu aniversário de quinze anos, as tartarugas titulares, Leonardo, Michelangelo, Raphael e Donatello, descobrem que a vida fora dos esgotos não é exatamente o que eles pensavam que seria. Agora, as tartarugas precisam trabalhar juntas como uma equipe para enfrentar novos inimigos que surgirem para conquistar a cidade de Nova York.
Dr. Evil e seu comparsa conseguem escapar da penitenciária e, juntamente com Goldmember, elaboram mais um arrojado plano de dominação mundial, que envolve uma viagem no tempo e ainda o sequestro de Nigel Powers, pai de Austin e o mais renomado espião de todos os tempos. Austin também viaja no tempo para deter os planos do trio de vilões, reencontrando em 1975 uma antiga namorada, Foxxy Cleopatra. Juntos, Austin e Foxxy devem salvar Nigel e impedir Dr. Evil e Goldmember de dominarem o mundo.